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1986 年，Johnstone 等在对体外培养的绵羊红细胞上清液进行超速离心时发现了一种囊泡状结构的小体，即外泌体（exosome）。外泌体是细胞主动分泌的，大小较为均一，直径为40~100 纳米和密度1.10~1.18g/ml 的囊泡状小体。
刚被发现时，外泌体是绵羊红细胞在成熟过程中将自身废物排出到细胞外的载体，血小板和白细胞几乎不分泌外泌体。此后，红细胞与外泌体的关系成为研究热点。直到1996 年，有学者发现EB 病毒转化的人的B 细胞内有一种富含主要组织相容性复合体II （MHCII）类分子的腔室，腔室内有一些囊泡状结构的小体被确认为外泌体，这揭开了外泌体研究的新方向 [1]。随着研究的进展，细胞外泌体被发现可携带多种蛋白质、mRNA 和miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程并且有可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。
然而，测量技术手段的局限限制了外泌体在这些领域的研究进展。本文总结了外泌体的纯化方法， 比较了现存的各种外泌体测量技术，重点介绍一种新的测量技术—纳米颗粒跟踪分析术（Nanosight Tracking Analysis, NTA）在外泌体尺寸和表征研究中的应用。
1. 外泌体结构
外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，是由多囊泡体与细胞膜融合后向胞外分泌的囊泡，具有脂质双分子层结构（图 1）。几乎所有的外泌体都有微管蛋白、肌动蛋白结合蛋白和四跨膜蛋白。由于其特殊的形成方式，外泌体不含内质网内的蛋白质， 而高表达细胞内源性蛋白质，如Alix 和Tsg101。不同细胞来源的外泌体蛋白组成存在差异，肠上皮细胞来源的外泌体含有多种代谢酶及肠组织特异性A33 抗原，B 细胞来源的外泌体富含CD86 和MHC 分子， T 细胞来源的外泌体表面有促凋亡的FasL 受体。Théry 等[2] 通过MALDI-TOF-MS 分析树突状细胞来源的外泌体， 鉴定出其主要成分为跨膜蛋白( Mac-1 αchain、MHC-II β chain、CD9）、细胞质蛋白（hsc73、annexin II、Gi2α） 和膜外蛋白乳脂肪球上皮生长因子8（milk fat globule-EGF factor 8 protein,MFG-E8）。其中，hsc73 是一种热休克蛋白，可以降低抗肿瘤免疫反应，MFG-E8 是膜外糖蛋白， 可结合αvβ3 和αvβ5 整合素（integrin）促进细胞粘附[3]。外泌体内的RNA 主要为小RNA，包括miRNA。miRNA 不仅仅是遗传信息的内源性调控者，也是调节细胞通讯的分泌因子及疾病的生物。 （图片） 2. 外泌体测量各种方法的比较
2.1 电子显微镜
透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM） 是以波长极短的电子束作为照明源，用电磁透镜聚焦成像的一种高分辨本领、高放大倍数的电子光学仪器。TEM 中，电子枪发射电子束， 在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑，照射在样品室内的样品上，进而透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透过的电子量多，最后经过物镜的会聚调焦和初级放大后，电子束进入下级的中间透镜和第1、第2 投影镜进行综合放大成像，最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏板上，这就是TEM 的基本原理 （图 2）。（图片） 鉴于TEM 的工作特点，在外泌体研究中，能够直接观察到样品中外泌体的形态。而且，TEM具有很高的分辨率， 能够鉴别大小不一的外泌体。但TEM 对样品的预处理和制备要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量。由于外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确地进行外泌体浓度的测量。
2.2 动态光散射技术
动态光散射的原理是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关仪器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度， 计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒则反之（图 3）。（图片） 在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10 纳米。相对于TEM 技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但是， 由于动态光散射技术是测量光强的波动数据，而光散射强度跟颗粒尺寸的六次方成正比，这就使得动态光散射技术无法分辨尺寸较小的颗粒。举例来说，将数量相等的5 纳米颗粒和50 纳米的球型颗粒混合，通过数量平均、体积平均和光强平均三种方式计算平均颗粒尺寸。从图中得出，大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号 （图 4）。 （图片） 所以动态光散射技术不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。
2.3 纳米颗粒跟踪分析技术
纳米颗粒跟踪分析技术（Nanosight Tracking Analysis, NTA）是一种比较新颖的表征纳米颗粒的方法，它可直接并实时观测纳米颗粒。NTA 通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号，拍摄一段纳米颗粒在溶液中做布朗运动的影像，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。
NTA 系统的工作原理是将一束能量集中的激光穿过玻璃棱镜，对样品（悬浮颗粒的溶液）进行照射（光路图见图5）。（图片） （图片） 激光光束从较小角度入射进入样品溶液，照亮溶液中的颗粒。配备相机的光学显微镜，被放置在特定的位置上，收集视野中被照亮的纳米颗粒发射出的光散射信号。样品池深约500 微米，采样点激光照亮宽度为20 微米，这个数值和光学显微镜聚焦的视野深度相匹配。相机会进行60 秒的影像拍摄，每秒30 个采样画面。NTA 软件分析颗粒的运动过程，并在每幅被记录的画面中鉴别和追踪做布朗运动的纳米颗粒。根据颗粒的运动速度，通过二维 Stokes-Einstein 方程计算颗粒流体力学半径 （图片） 在方程中2 是均方位移，KB 是Boltzmann 常数；T 是溶液的温度， 单位是Kelvin；ts 是采样时间，例如， 1/30 fpsec = 33 msec；η 是溶液粘度； dh 是流体力学直径。 NTA 检测颗粒大小的范围和颗粒本身的折光指数相关。测量的下限取决于被研究颗粒和背景之间信噪比，也就是颗粒的散射光强度和背景的光强差距。颗粒的散射光强度根据Rayleigh 散射方程，受到以下因素的影响。 （图片） 其中，d 是颗粒的直径，λ 是入射光的波长，n 是颗粒和溶液的折光系数比。通常来说，生物样品如外泌体等， 折光系数较低，所以测量下限为30-40 纳米。
由于NTA 技术是直接追踪样品中每一个纳米颗粒，决定了NTA 对复杂的样品具有极高的分辨率。为证明NTA 对于复杂样品的分辨能力，我们将100 纳米和300 纳米两种不同大小的聚苯乙烯颗粒按照5:1 的数量混合，使用NTA 技术进行测量（图6A）。尽管其分布图形有一定的重叠，但两种不同大小的纳米颗粒的峰清楚地区分开来。这种对复杂样品的分辨能力对于外泌体这样的研究对象来说是非常重要的。（图片） NTA 也能对样品浓度进行直接测量。对一系列浓度为1×108 -8×108 的100 纳米单分散样品进行测量，可看到NTA 测量浓度结果和实际浓度存在着很好的线性相关（图6B）。对于多分散体系，测量结果的准确取决于仪器参数的设定（照相机快门速度和光圈）， 恰当的参数设定可以保证不同大小颗粒都被NTA 软件追踪和计算。
NTA 还具有分析荧光样品的能力。NTA 有405 纳米、488 纳米、532 纳米和635 纳米四种不同波长的激光器可供选择，搭配相应的滤光片，可实现对荧光样品的测量。将100 纳米荧光标记的颗粒和200 纳米非荧光颗粒用同一溶剂做成混合样品，使用NTA 进行测量（图7）。图7 中，蓝色的线显示为NTA 的光散射模式，可以看到尽管100 纳米和200 纳米颗粒的分布图有重叠，但还是清楚的区分了100 纳米和200 纳米的峰值。然后使用荧光滤光片进行分析，只观测到100 纳米的荧光标记的纳米颗粒（红线）。（图片） 外泌体表面有标志物CD9、CD63 等跨膜分子的存在 [4]，在复杂的背景环境下（如血清中），可用荧光抗体标记外泌体，用NTA 的荧光测量功能实现在复杂背景下对外泌体的测量。同流式细胞仪的荧光功能相比，NTA 的分辨率较高，测量荧光颗粒的下限可达30-40 纳米，而流式细胞仪的测量下限仅为400 纳米。即使是最新一代数码流式细胞仪， 其测量下限是100 纳米。但由于流式细胞仪仍然建立在监测光信号的基础上， 测量的准确性和分辨率仍然不可靠。利用NTA 系统对外泌体进行测量时，其荧光功能具有独特的优势。
3. 讨论和展望
近年来，外泌体的研究不断升温。既有对外泌体免疫功能的研究，也有对外泌体中miRNA的研究， 特别是外泌体作为特定靶向的抗肿瘤疫苗的研究获得持续关注。但外泌体的抗肿瘤作用具体是增强免疫还是引起耐受，是促进增殖还是诱发凋亡，内在的机制仍需深层次探讨。
外泌体作为生物标志物的研究目前处于起步阶段。我们抽取结肠癌患者和正常人的外周血，对其外周血中存在的外泌体进行分析，如图 8， 可见正常人和结肠癌患者外周血中外泌体的浓度和分布存在着显著的差异，具有较好的临床指示意义。（图片） 上述实验数据表明临床诊断中，外泌体作为生物标志物具有良好的临床应用前景。在临床诊断中， 简单快速地在复杂的生物背景下( 如血浆、尿液) 测量外泌体浓度、大小和表征数据是必备的要求， 目前存在的传统方法都无法完美的解决这一问题。NTA 作为一种全新的测量技术， 具有实时观测、较高的分辨率、准确的浓度测量和荧光测量功能，提供了对外泌体大小和浓度研究的新思路。
11/7/2014
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