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包括模型微生物选择在内的常见做法映射了工艺知识的缺乏。这是由科学、非理性恐惧，还是市场所驱动？
毫不奇怪，对于像无菌过滤这样关键和敏感的过程，许多滤器的终端用户会体验一些“失败的恐惧。”正如风险管理顾问Peter Sandman所说，当人们觉得事情无法控制的时候他们就会感到恐惧。因此，有些人可能会认为以前所建立的无菌过滤的做法并不充分。迫于害怕做更多不必要的事情，他们可能会对其过滤系统做过量的设计，增加浪费和昂贵的程序。
怀着这种恐惧，而不是去研究过滤器的渗透和每个进程的具体根源，无菌过滤的从业人员就会阻碍整个行业和全球的监管机构对过滤科学的理解和进步。
本文将考察当下成为企业负担的一些不必要的做法，并使用过程验证原则来解释为什么他们是不充分的。此外，当用于评价无菌滤器的“模型微生物”被认为是一种可以描述所有过程中的情况和过滤器类型的通用原型时，一些问题就会产生。本文也将就这些问题进行讨论。
首先，让我们考虑验证概念本身，验证就是“建立文件化的证据，所提供的证据可以高度保证：一个特定的过程将始终如一地生产一种产品，并满足其预先确定的标准和质量属性。
验证是全球药监机构对药品生产，特别是对无菌过程的要求。如行业顾问吉姆艾盖洛柯所写，已经有大量关于人体无菌注射生物技术产品的最好的验证方法的知识，包括：流体对微生物、聚合物膜和保留机制的影响，过滤器工艺参数对聚合物膜、滤器构造和保留机制的影响。
即使验证过程在控制之中，但其可靠性仍然被监管机构和业内人士所质疑，这表明，很多从业者并不完全了解验证的概念。这往往可以追溯到主观的恐惧，而不是有效的技术问题。
这里有一些例子，来自监管机构或公司目前关注、要求或实践的文件，从中我们可以看出这些顾虑：
◆“微生物可以透过0.2微米的过滤器，所以，这个行业必须切换到0.1微米级过滤器。”
◆“在我们的过程中越来越多的检测到非可培养的微生物、L型或纳米细菌。”
◆ “冗余的0.2微米过滤器是必要的，应该被使用。”
◆“我需要一个绝对的0.1或0.2微米的过滤器。”
◆“扩散流的完整性测试比起泡点测试更好。”（目前，在美国和欧洲监管机构之间存在偏好差异）。
◆“有缺陷的过滤器不会被后续利用测试检测到，因为滤孔会在过滤过程中堵塞。”
◆“无菌过滤前初始污染菌的最大值是10cfu/100mL。”
但是，首先，让我们考虑行业目前所了解的“模型微生物”在滤器测试和验证实践中的作用。考虑到制药设备中微生物的数量和多样性，这个行业显然需要一种模型，因为测试每一个微生物将是不切实际的。此外，大部分微生物都不受关注，因为它们的大小对现代无菌级过滤器根本不具备挑战性。
现在的问题是 ：最广泛使用的模型微生物，总能反映具体过程和过滤器的特点吗？
除了尺寸排除：没有通用的模型微生物
缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）是在药品生产环境中发现的微生物，通常被用作模型微生物，预计将它被选中，是因为其出现在制药的操作过程和初始污染菌中。
由于尺寸合适、易于培养，这种微生物特别适合验证无菌级过滤器。尽管如此，它作为模型应该只用于下面的情况：在特定的应用中，尺寸与所感兴趣的微生物密切匹配，并与过滤器的孔隙大小和形状相关。
此外，在某些情况下，筛保留可能无法去除微生物。例如，在某些情况下，它可能会被吸附，微生物在过滤器的聚合物表面形成氢键。这可以来源于26年前的观察：绿脓杆菌在聚酰胺膜上比三醋酸纤维素膜过滤器被保留更多。这也解释了在表面活性剂存在的情况下，乳胶颗粒可以被聚酰胺膜从水悬浮液中去除，但不是在表面活性剂缺席的情况下（见表1）。 （图片） 缺陷短波单胞菌不应被视为一种通用的模型微生物，因为一些初始污染菌可能是更好的替代微生物，更贴近实际的过程设置情况。不幸的是，无菌滤器弱的穿透引起对滤器过滤的可靠性的质疑。适当的过程验证可以打消这样的疑问，即便是最严格的无菌过滤的专家。
变异来源：尺寸和形状
缺陷短波单胞菌有不同的大小和形状，具体取决于它是如何培养。早在1967年，鲍曼和他的同事们描述缺陷短波单胞菌的大小为0.38×1.0微米。然而，在1978年，莱希和沙利文发现，30℃长出来的微生物，在生理盐水乳糖肉汤（一种最低限度的营养介质）中培养24小时，得到约0.3×1.0微米的球菌样细胞（图1）。使用原始生物污染菌的形式进行微生物挑战测试时，要有类似的考虑。（图片） 缺陷短波单胞菌通常被培养成为球形，因为球是最适合保留的。因此，早在1978年，莱希和沙利文便提出，缺陷短波单胞菌应该被作为在0.2/0.22微米级膜使用的模型微生物，部分原因是因为其尺寸与0.2微米尺径接近。
随后，FDA指定其用于特殊目的，定义一个除菌过滤器，每平方厘米的有效过滤面积（EFA）应截留至少1×107 cfu的缺陷短波单胞菌 ATCC19146。
虽然缺陷短波单胞菌不是已知最小的微生物，但其足以代表目前医药制剂中存在的任何更小的微生物。测试的微生物越小，逻辑上讲，滤器越有可能确保截留较大的微生物。
然而，培养和处理的容易性和安全性也是很重要的考虑因素。在2001年，孙达拉姆和他的同事们发现，越来越多的情况下，在0.2/0.22-μm级膜除菌过滤失败 。实验研究表明，穿透微生物发生萎缩，因为他们一直在肉汤培养，营养不足。在这种情况下，悬浮液的物理化学性质可能改变悬浮微生物的大小，表现为离子强度带来的唐南平衡变化。
在加工过程中的微生物收缩
孙达拉姆的团队还发现，微生物接触某些药物后大小会发生变化。在使用0.2微米级滤膜的例子中，研究人员发现，在渗透发生之前，随时间的延长，只有较大的孔径能提供除菌过滤和/或某些微生物的高的滴度减少。
累积挑战的渗透时间从24至96小时不等，首次观察到渗透的范围从1.2× 107到1.1× 108 cfu/cm2。两个0.2微米级尼龙66系列过滤器无法完全截留皮氏罗尔斯顿菌(现在是皮氏伯克霍尔德氏菌)，在72小时观察到渗透。相应的累积挑战值是2.4 ×107 cfu/cm2。Krygier和他的同事们在1986年发现，与PVDF膜相比，尼龙66膜有更广泛的渗透性，保持其开放程度更大。因此，建议0.1微米级滤膜取代0.2微米级滤膜。
孙达拉姆的团队评估了5个0.1微米级的膜，并发现它们在整个测试（120-196小时）期间保持无菌，挑战水平从5.7×107到2.0×108 cfu/cm2。聚偏氟乙烯过滤器测试获得了类似的结果;挑战值为5.9 x107-6.0×108 cfu/cm2。
此外，所有0.1微米级过滤器测试的整个期间（120-192小时）都能保证一致和完整的截留皮氏伯克霍尔德氏菌，表明当传统的0.2和0.22微米过滤器发生渗透时，较小的滤孔会确保得到无菌产品。支持者认为，采用0.1微米级滤膜会允许处方和过滤的长期操作。事实上，0.1微米级过滤器可能是最好的长期过滤的选择。
然而，在0.1微米级过滤器也发现有渗漏现象。在1999年，孙达拉姆的研究小组发现，当皮氏伯克霍尔德氏菌的大小是限定因素时，它可以被某些0.1微米级过滤器所截留。但是，在类似的情况，他们发现，七个市售的0.1微米级的滤膜只有四个可以删除特定的微生物。仅仅因为一种类型的膜可以提供适当的截留，并不意味着任何其他的0.1微米级的膜也可以依赖这样的结果。
重要的是要记住，当下， 0.1微米过滤器没有普遍适用的行业标准。此外，更多的研究显然需要做微生物的大小变化背后的动力学，来评估在不同的流体中的不同微生物。
根据现有数据，长期过滤最好是用0.1微米级的过滤器处置，进行验证处理。然而，在其他情况下，用0.1微米取代0.2微米级的膜可能是不必要的，并可能导致重大处罚，包括：
◆较慢的流量和处理率，导致操作时间更长；
◆更高的必需脂肪酸费用；
◆更多的浸出和萃取物；
◆更高的产品损失，由于最终使用更大的过滤面积造成的吸附粘合。
作为一个负责任的选择需要对0.1微米级膜和0.2微米级的膜进行验证。
如果两种类型的过滤都证明是适当的，应使用更高的孔径评级，以避免流量减少的处罚。但是，如果验证数据得不到清晰的决议，应使用0.1微米级滤膜，因为截留比流苏或流量更重要。
下面，我们列出了一些常见的由于恐惧产生的对无菌过滤的关注，要求或做法，只有细致的工艺验证才能最好地解决。
“0.2微米的过滤器会渗透微生物。因此，该行业需要切换到0.1微米级的过滤器。”
在某些特定的进程中，微生物可以透过0.2微米级过滤器，甚至这类滤器通常会截留的微生物也会透过。在这种情况下，过滤除菌最好使用0.1微米级过滤器。这样的实例并不新鲜。监管机构已经注意这种情况很多年了，至少PDA和FDA关于这一主题于1995年举行了一个特别论坛。
某些生物，如皮氏伯克霍尔德氏菌，洋葱伯克霍尔德菌和绿脓杆菌长期浸泡在最低限度的营养液体中会发生萎缩。由于尺寸的减少，此时使用缺陷短波单胞菌作为模型就是无效验证。缺陷短波单胞菌在有最低营养液中形状会发生改变，但与过程流体的接触其大小并不发生改变。
事实上，尽管一些微生物需要0.1微米级过滤器才能截留它们，但这并不意味着所有微生物都是如此处置。从0.2微米转换到0.1微米级滤器，只发生在大约0.005％ - 0.01％的除菌级过滤应用中。
因此，强制的转换并不科学，统计学上也毫无根据的。法令的颁布可能会让人避之唯恐不及，工艺验证的活动和数据用于性能验证。单纯依赖孔径率被认为已经过时了。
“在我们的流程，越来越多的检出非可培养生物或L型或纳米大小的细菌。”
如果不使用培养和计数量化的方法，就不能作出有关微生物无菌过滤的结论。 L型细菌、纳米细菌，和“非可培养”的生物，可能不适合这种分析。关注他们的存在可能是合理的，但如果没有培养和计数的手段，完全去除它们是不可能的。
因此，除菌过滤器只能通过其在去除药物制剂中已知的鉴定的和可培养微生物的表现来判断。由于影响除菌过滤结果的因素复杂，需要一个仔细的过程的验证，包括过滤器。特别的药物制剂，确切的滤膜类型，精确的过滤条件，所关注的特定的生物体类型，必须采用必要的验证。
事实上，一些微生物需要0.1微米级过滤器，逮捕他们，并不意味着所有微生物都是如此处置。从必要的开关0.2微米到0.1微米级，发生在只有大约0.005% - 0.01%的除菌级过滤应用。
“冗余0.2微米的过滤是必要的，应使用”
不一定。适当的工艺验证可以提示一个单独的滤器是否能起作用。不过，也有一些传统的应用，无论出于何种原因，利用第二个（冗余）过滤器作为“保险过滤器”，也就是说，如果第一个过滤器失败，第二个可以亡羊补牢。尽管如此，只有当每一个过滤器都经过截留验证，这种理论才行得通。
即便如此，实践的智慧，值得仔细评估，因为它假定膜的必须脂肪酸成本增加，增加溶出物和萃取物。滤器提高产品拦截和非特定吸附会引起产品的不必要损失。
“除菌过滤前初始污染菌的最大数应为10 CFU每100毫升液体。”
如果一个人希望符合EMA的法规，特别是如果一个人希望出口产品到欧洲。那么，这是真实的，美国食品药物监督管理局（FDA）没有这样的规定，但基本上认同过程验证。
相同的前提下出现这两种观点看似冲突。 EMA的法规试图建立热杀菌过滤的同一无菌保证水平（SAL）。 EMA认识到，挑战的数目越多，就越有可能至少有一个会成功。
FDA似乎同意，如果过滤器持续去除的生物负荷远远高于现实情况，它可以保证承受较小的侮辱。如作者所看到的，如果FDA的巨大挑战无法破坏滤孔，那么就没有需要在过滤器前进行生物负荷评估。滤器验证将为预期的目的服务。有效开展的过程验证，将可靠的论证滤器的作用。
“我需要一个绝对的0.1或0.2微米级的过滤器。”
一个前FDA的权威，已经退休，曾经指出，“‘绝对’这个词应该只是伏特加的作用下才使用。”绝对性意味着不管任何其他因素，完全独立于条件，内在截留能力大于滤器的孔隙率。没有对粒子和滤孔的性质的完整知识，这个陈述缺乏技术意义或指导。也许，它可能被用来在无知的人身上（尽管玩世不恭的人可能会怀疑它由从市场营销力量衍生的实用性，这种做法不会在竞争激烈的销售世界中产生。）
控制vs恐惧
如SANDMAN所述，人类有控制欲望的天性，然而，如果一旦无法实现，则可能会迅速转变为恐惧。不幸的是，无菌过滤时，恐惧会导致安装的浪费，不必要的安全网，进而产生更多的问题。
控制，是理想的状态，但这种控制只能来自工艺验证研究。他们的权威至少同开尔文勋爵的基本科学原理一样老，“当你能够测量你谈论的，并可以用数字表达它，那么表明你有所了解。”
这充分说明验证。在药品生产的大部分地区，以科学为基础的验证是对无菌过滤恐惧最好的治疗。
3/26/2013
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