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随着2010版GMP的颁布和进一步实施，无菌药品生产中“除菌过滤工艺”的风险管理和验证受到制药行业的极大关注。除菌过滤器提供商提供的《标准验证指南》（Validation Guide）为过滤器的验证提供标准，包括实验室条件下进行的测试数据和标准值。例如：过滤器耐受灭菌的时间和次数、过滤器耐受的最高温度和最大压差、化学兼容性；过滤器溶出物和生物安全性测试，以及该条件下细菌挑战测试和完整性测试参数等。
3M《标准验证指南》对过滤器验证项目做了详尽描述，通过严格验证确保过滤器应用和性能的一致性和稳定性，做到除菌过滤工艺的零风险。而对于具体药液中的除菌过滤，溶剂、温度、压力、过滤时间等都与实验室条件不同，则必须按照GMP的要求，进行工艺条件下的“再验证”。验证内容包括但不仅限于，药液对除菌过滤器的影响：化学相容性试验（Compatibility testing）和完整性试验（Product-wet integrity test）；除菌过滤器对料液的影响：溶出物试验 （Extractable testing）和吸附试验（Adsorption testing）；药液对除菌过滤器细菌截留率的影响：细菌存活试验（Bacterial viability testing ）和细菌截留试验 （Bacterial challenge testing ）。限于篇幅，本文结合理论和实际，重点介绍细菌截留实验的原理和方法，为细菌截留实验提供技术参考和理论依据。
除菌过滤工艺
除菌过滤的目的是从原料药液里通过过滤去除细菌。如果产品无法进行最终灭菌，需要采用0.22mm（更小或相同过滤效力）的除菌过滤器进行除菌过滤。新版GMP附录1 “第十三章，非最终灭菌产品的过滤”第九十一条规定，与其他灭菌方法相比，除菌过滤的风险最大，因此，宜安装第二只已灭菌的除菌过滤器再过滤一次药液。图一为除菌过滤工艺的工艺流程示意图，澄清过滤一般采用深层滤芯，去除料液中的不纯物质，降低料液浊度和生物负荷度。无菌过滤点采用预过滤与除菌过滤组合的方式确保除菌效率和滤芯过滤性能的稳定性。法规要求的第一个要点是在采用除菌过滤方法时，首先确认采用的过滤器为“除菌级”，达到此要求后，除菌过滤法中的其它无菌保障措施才有意义。定义过滤器是否为除菌级，需要依靠过滤器的微生物截留能力，并完成相关的标准方法验证和工艺验证。目前业界缺乏统一标准来衡量孔径，孔径的标准对预测微生物截留和比较不同生产商生产的过滤器没有实际的意义，因而，需要用微生物截留能力来定义除菌级过滤器（2010版-无菌制剂GMP实施指南）。以此可以看出细菌截留试验对于除菌滤芯验证的重要性。 （图片） 细菌截留实验准备
新版GMP实施指南中提到除菌级过滤器验证的两个主要因素：一是滤膜的级别，要求可适用的标准化试验或类似的方法以细菌挑战的方式进行；二是工艺验证，由过滤器的使用者或指派的实验设施（例如，过滤器的生产者或协议实验室），使用有代表性的微生物进行挑战，证明过滤器在生产条件下，可以完全去除每个产品或产品家族中的微生物。应建立针对每个产品组的科学解释并可能需要在实施验证前经合适的监管机构审查。细菌截留实验就可以完全验证过滤滤芯的细菌截留性能，也可以充分反映整个工艺环节对滤芯过滤性能的影响。因此，在截留试验前必须做好如下准备：
过滤工艺评估：通过验证服务调查问卷，客户沟通甚至现场拜访，需要完全了解客户工艺流程，包括溶剂性质（例如水基的、酸、碱、有机的）、过滤时间、工艺压差、工艺流速、工艺温度和过滤器设计规范，实验室根据具体的情况，再结合过滤器本身的一些特性，模拟缩小化的工艺流程，这些流程需要与实际工艺流程相符或者更为恶劣，确保细菌截留实验完全按照或者更高于实际工艺制定。
细菌培养和筛选：细菌截留试验采用缺陷假单胞菌（Brevundimonas diminuta, ATCC 19146），要求通过光学显微镜或者扫描电镜观察，直径为0.3-0.4微米, 长度为0.6-1.0微米，且呈单分散状态，这些重要特性需每次进行观察和筛选，以免对截留试验造成影响。
膜片准备：根据PDA 26号报告，至少应该选择3个批号滤膜，且需有一个批号的滤膜靠近该膜片的最小临界值。并且在进行细菌挑战前和后，这些膜片应进行完整性测试，数值需符合或超出滤芯厂家给出的判定值，最终将结果记录于报告中。表1是3M中国有限公司为某国内药厂做的验证服务记录的相关数据，包含了细菌截留前和后的完整性数据，且都符合滤芯厂家给出的参考值。（图片） 环境要求：为了消除周围环境菌的影响，避免对后期的分析造成干扰，试验要求在专门的微生物洁净室内（class100000）进行，具体的整个试验过程需要在二级生物安全柜中进行，且整个洁净间需要定期进行消毒。
除菌过滤滤芯选择
目前液体除菌滤芯主要有聚醚砜膜（PES）滤芯（图2），尼龙膜（Nylon）滤芯（图3），聚偏氟乙烯膜（PVDF）滤芯，聚四氟乙烯膜（PTFE）滤芯等。滤膜又分亲水膜和疏水膜，对于部分有机相溶剂料液，需要根据实际要求采用疏水膜过滤滤芯。在除菌滤芯的选择上，药厂主要根据滤芯供应商推荐或者依赖某个品牌。其实除菌滤芯选择主要是由以下几个因素决定的，这也再次论证了滤芯验证服务的重要性。
* 滤芯材质（化学兼容性）
* 细菌截留率
* 流速
* 使用寿命
* 热稳定性
* 化学稳定性（图片） 细菌截留实验介绍
根据ASTM838-83对除菌级滤芯的定义，用107 CFU/cm2 的缺陷性假单胞菌（ATCC 19146 ）进行试验，下游滤出液无菌。细菌挑战试验研究的目的就是通过实验获得文件证据，证明在模拟工艺条件下，过滤过程可以持续去除悬浮于产品或替代流体中的高水平的标准细菌或相关微生物污染分离物。
细菌截留试验进行前，需要先进行细菌存活性试验，来了解客户产品在模拟的工艺条件下对截留菌生长的影响，试想如果客户产品在模拟工艺条件下，会对截留菌生长造成影响，甚至无法存活，那分析滤膜未发现截留菌，是产品对截留菌的影响造成还是测试滤膜过滤的缘故都无从而知，因此细菌存活性试验是截留试验的预实验，可以为截留试验提供重要的理论依据，以此来确定截留试验的过程，是采用单步还是多步进行试验。
细菌截留试验测试过程中使用如图4所示装置，一共包括CTL1-4四套截留装置，CTL1-3即为所要验证滤芯的三个重复，CTL-4为整个实验的对照组，其中TF1，2，3分别为不同批号的测试滤膜，为过滤精度为0.22微米或者0.2微米的除菌滤膜，且每个TF上下游都加装压力表，用于监控整个实验过程中，测试滤膜两端的压力，TF4为对照，为过滤精度为0.45微米的滤膜，AF-1，2，3，4均为分析滤膜。实验过程中将产品或者替代液配置成一定浓度的挑战液，一般要求不低于107 CFU/cm2，按照模拟的缩小化工艺条件，采用蠕动泵将其按照一定的速度通过测试和分析滤膜，在试验过程中，需要在不同时间点，对压力，流速，温度等关键参数进行监控并记录，且在细菌截留试验开始前和结束后，对微生物进行平板菌落计数确定挑战菌的浓度。
当截留试验结束后，需要将分析滤膜放于平板上培养，如果上游的测试滤膜为除菌滤膜，即图中的TF1，2，3，则下游即分析滤膜上不会发现截留菌生长，如果上游的测试滤膜为非除菌滤膜即TF-4，则下游即分析滤膜上会发现挑战菌生长。根据分析滤膜上是否有挑战菌生长进行判断，对于对照CTL-4，因0.45微米滤膜对于挑战菌浓度在104～106CFU/cm2时，无法达到除菌过滤的效果，所以对照组下游的分析滤膜，即AF-4必定会有挑战菌的生长，这样一则可以对挑战菌进行鉴定，鉴定该挑战菌的纯度及形态特征，二则可以判断挑战液的浓度是否已经达到预期的浓度。（图片） 实验结果与分析
细菌截留实验结果包括细菌截留前后膜片完整性测试值，阴性对照结果，产品循环工艺参数和分析膜片结果四个部分。如表1记录了实验膜片完整性测试结果，从中可以对截留试验前和后，滤膜的完整性数据进行评估，是否符合滤芯厂家对于该类滤芯的完整性要求。（图片） 表2阴性对照结果，需要确认在未接种截留菌前整个截留装置是否保持无菌。表三为分析滤膜结果，也是决定细菌截留试验成败的关键指标，分为两部分，第一部分为截留菌的浓度，需按要求菌不低于107 CFU/cm2，可以分析达到了ASTM-838对除菌级滤芯截留浓度的要求，另外一部分为分析滤膜的结果，对于TCL-1，2，3装置中AF均未发现截留菌，说明TF可以恒定高效的去除挑战液中的截留菌，对于对照组的TCL-4下游的AF4，则发现有截留菌生长，可以利用特定的鉴定试剂盒，对结果进行鉴定，确认下游所发现的细菌有且仅为我们的标准截留菌。（图片） 结论
通过实验结果的阐述和分析，需要对此次细菌验证实验进行总结。3M中国有限公司提供的细菌截留实验报告中会呈现三条总结，以下为某细菌截留实验报告总结。
1. 某公司使用3M除菌滤芯（如LifeASSURE? PDA PDA020F50JA）进行某药液的除菌过滤。试验在3M中国过滤验证服务中心进行，本报告阐述了在模拟生产工艺条件下细菌挑战试验的测试结果。
2. 当缺陷性假单胞菌的挑战浓度高于107 CFU/cm2时，所有测试膜片的滤出液全部无菌，测试结果符合判定标准。
3. 某公司在某药液生产中使用LifeASSURE? PDA PDA020F50JA滤芯进行除菌过滤，可以去除高水平负荷的缺陷性假单胞菌（ATCC19146）。
3/26/2013
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