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基于固态激光器的简单易用的单箱相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜，省去了两台要求高度同步的掺钛蓝宝石激光器。
Heinz P. Huber，Sandra Zoppel，Ingo Rimke
在过去的十年间，基于非线性光学效应的多光子显微技术在提高显微成像对比度和分辨率方面日益得到重视。通过增加照明光源的强度，这些非线性效应提高了图像的横向和纵向分辨率，实现了微尺度范围内的三维成像。在诸多多光子成像技术中，双光子激发荧光显微镜被广为采用，每年至少要安装几百套基于该技术的系统。[1]双光子成像使用同时吸收两个光子的办法来激发一个染料分子，其目的是获得跟激发波长相比具有蓝移的荧光。
可调谐飞秒激光被用作双光子激发的光源。通过共焦显微镜，荧光信号可以很容易地从激发背景中探测到，在现代生命科学中利用特定的染料分子，几乎可以看到所有的生理过程。
然而，双光子荧光显微镜的最大缺点是使用染料来成像，因为它们的毒性会改变机体内的生理过程。荧光蛋白质（如绿荧光蛋白）经常被用来代替染料，但是这种方法涉及复杂的基因样本复制技术。此外，这些染料在数分钟内被漂白的特性，将使荧光信号逐渐减弱。
基于非线性光学效应的一些方法被用于克服与染料相关的问题，这些效应包括二次或三次谐波产生（SHG或THG）、拉曼散射，或是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。CARS是一个涉及四个光子的三阶非线性效应（X(3)过程）。
在CARS过程中，频率为ωp的泵浦光和频率为ωs的斯托克斯光把样品激发到一个虚态（virtual state），并产生频率为ωp-ωs的分子振动。如果ωp-ωs等于分子的特征拉曼频率Ω，这种振动激发就会非常有效。通过三阶非线性过程产生的频率为ωas = (ωp-ωs) + ωp的反斯托克斯边带是最终的测量信号（见图1）。通过主动驱动振荡和相干作用，CARS信号会远远高于普通的拉曼散射。 （图片）
图1：在CARS方案中，泵浦脉冲（ωp）和斯托克斯脉冲（ωs）产生了信号频率（ωas）。 使用CARS进行成像可以获得相同的对比度而不需要使用染料，产生较强的频率为ωas的蓝移信号，可以很容易地从激发背景中区分和探测（见图2）。CARS信号对样品的振动模敏感，可以对活体内的分子振动密度成像。（图片） （图片）
图2：CARS显微镜捕获的线虫（上图）和活酵母细胞（下图）展示了高对比度和较高的图像质量，这也证明了这种技术的可行性。在线虫图像里，可以清楚地看到肠道和受精卵。肠道中血脂在2845cm-1产生很强的CARS信号（积分时间为5s）。活酵母细胞在2845cm-1共振处被记录（积分时间是1s）。两幅图的尺寸都是150×150 µm (1024 × 1024)。 由于在这个过程中涉及4个光子，其中包括两种频率的泵浦光源（泵浦脉冲和斯托克斯脉冲），这两个脉冲在时间上需要精确的同步。以前用两台掺钛蓝宝石飞秒激光器通过电子同步器实现同步，由此带来的缺点是时间上的抖动，从而引起CARS信号的强烈波动。与之前的这种方法相比，使用一台具有同步泵浦光学参量振荡器（OPO）的激光器从根本上消除了时间抖动。哈佛大学Sunney Xie的研究小组与APE和High Q Laser公司合作，利用后者研发的一台高功率皮秒激光器和一台同步泵浦的OPO实现了这种方法。[3]这种方法由于具有良好的时间同步性，从而在CARS领域被广泛使用，但是它仍然由两套独立的设备组成。
减小光源尺寸
随着CARS显微镜从物理学实验室转移到生命科学实验室，对简单易用的光源的需求与日俱增。因此，APE与High Q Laser公司联手开发了远程控制、真正免提单箱CARS光源“picoEmerald”，它能从单一光束出口提供两个可调谐的超快脉冲串。
皮秒光源基于单级非对称稳定优化的振动器，其输出为功率4W、波长532nm、重复率80MHz的空间衍射极限光束。此外，激光振荡器可以主动稳定在优化的功率水平。
乍看起来，这种OPO技术似乎与先前的Emerald激光器一样，使用温度调谐的非临界相位匹配三硼酸锂作为增益介质，以及一个Lyot滤波器用于波长的精细调谐。但事实上，该系统的整体尺寸大为减小，包括泵浦激光和光束整形器只有以前OPO体积的70%。基于有限元分析的新型激光腔设计具有最大的被动稳定性，并被集成到单一的铝箱中。任何可能的漂移都被主动稳定控制的单元比如腔长和倾斜镜补偿，所有器件都通过计算机控制，不需要任何手动调节。
标准的CARS装置使用1064nm光作为斯托克斯脉冲，OPO信号光作为泵浦脉冲，其能量差范围在700～5000cm-1。其他的CARS装置使用信号光和闲频光脉冲（1400～10000cm-1）用于更大的穿透深度，这来自于红移的激发波长。[4]
相比较，picoEmerald提供了三个全部自动的在时间上和空间重叠的超快脉冲串：激光振荡器输出1064nm、从OPO输出690～990nm的信号光和1150～2300nm的闲频光。OPO内置的控制器可以控制功率的稳定和波长的调谐，泵浦光和斯托克斯光整形后被发送到显微镜。用户只需要选择工作模式：信号光和闲频光，或者信号光和1064nm泵浦光，以及使用的激光功率。
对于第一种模式，信号光和闲频光离开OPO振荡器后，在时间和空间上完美地重叠在一起，由于使用调谐范围在1350～10000cm-1红移的激发波长，因此具有更大的穿透深度。对于第二种模式，OPO的信号光和1064nm泵浦脉冲配合使用，调谐范围是650～5000cm-1，目前这种模式被大多数研究人员采用。
与以前的系统不同的是，在以前的系统中需要用户调节脉冲在时间和空间上的重叠，在新系统中这些都可以在激光器内部完成，利用传感器自动调整空间的重叠。在OPO的出口测量脉冲在时间上的重叠，然而由于样品的色散，在样品中的脉冲重叠与其在出口处存在微小的差异。初始的延时就足以产生CARS信号，然后通过电子自动优化可以获得最高的信号。1064nm光束以及信号光和闲频光可以通过衰减达到所需的功率水平。这种功率水平被监控，并可以在数小时内保持在同一个值。
CARS显微镜中分子振动模式的典型带宽为10cm-1。对于具有变换极限的脉冲而言，这对应于大约2ps的脉宽，更短的脉冲就会降低光谱分辨率，而更长的脉冲则降低了CARS四波混频过程的效率。PicoEmerald提供7ps的1064nm脉冲以及5～6ns的OPO输出脉冲，以使这种平衡达到最优化。
新的显微方法
与其他的成像技术相比，CARS技术除了一些优点外也有一些缺点。最重要的一点是相对较强的与波长无关的非共振背景，这会导致测量的谱型与拉曼光谱有所区别，因而限制了探测灵敏度。
解决这个问题的一个办法是利用受激拉曼散射（SRS），这已经被多个研究小组采用。目前最灵敏的结果是哈佛大学Sunney Xie研究小组采用一套Levante Emerald OPO系统完成的。[5]除了标准的CARS装置外，该研究小组还使用了一个强度调制器放置在其中一路光束中（比如斯托克斯光束），这样其他光束的强度调制结果（比如泵浦光束，表现为受激拉曼损耗）就会被探测到。然而，调制深度比信号光小4-8个数量级，这需要非常好的锁定放大技术。即使如此，研究结果显示，与直接提取拉曼谱的CARS技术相比，该种方法使灵敏度得到了提高，并且信号强度与样品浓度成线性关系。
另一项有价值的消除非相干背景的技术是外差CARS。[6]这种方法采用1064nm光束的二次谐波泵浦的OPO。使用1064nm光束作为泵浦光，以及OPO的闲频光作为斯托克斯光产生的CARS信号的波长，与OPO的信号光束正好一样。使用声光调制器对1064nm光束进行频率调制，使CARS信号与OPO的信号光束重叠，使用锁定放大技术就可以提取X(3) 的虚部，也就是说可以提取拉曼信号并抑制非共振背景。因为这两项技术都须要对1064nm光束进行调制，下一代picoEmerald产品计划增加一个可选的声光调制器。
参考文献：
1. W. Denk et al., Science 248(4951) p. 73 (1990).
2. A. Zumbusch et al., Phys. Rev. Lett. 82, p. 4014 (1999).
3. E. Büttner et al., Proc. SPIE 6442, 64420C (2007).
4. F. Ganikhanov et al., Optics Lett. 31, p. 1292 (2006).
5. C. W. Freudiger et al., Science 322, p. 1857 (2008).
6. M. Jurna et al., Optics Express 15(23) p. 15207 (2007).
11/26/2009
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