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高速逆流色谱在天然产物分离中的应用
祝顺琴 谈锋
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摘要:综述了高速逆流色谱在天然产物有效成分分离中的新应用。
关键词:高速逆流色谱;天然产物;分离;综述
中图分类号:R944.9 文献标识码:A 文章编号:1001-8255(2005)12-0788-04
高速逆流色谱( high-speed counter-current chromatography,HSCCC)是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同,从而进行分离的色谱法。逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱到现在的HSCCC 历程数十年,技术和设备日臻成熟,广泛应用于中药及天然药物的研发。本文综述了HSCCC 在天然产物分离中的新应用。
1 HSCCC的原理和特点
HSCCC 的流动相、固定相均为液体,且互不相溶。利用螺旋柱运动时产生的离心力,使两相溶剂系统不断混合。固定相保留在聚四氟乙烯管中,利用恒流泵连续输入流动相,随流动相进入螺旋柱的溶质在两相间持续分配,按分配系数大小被先后洗脱。
HSCCC 有几个突出优点:( 1) 无不可逆吸附。聚四氟乙烯管中的固定相无需载体,为液- 液色谱系统,故而消除了气- 液和固- 液色谱中因使用载体而带来的吸附现象,特别适于分离极性物质和生物活性物质;( 2) 高回收率。由于流动相和固定相均为液体,样品可全部回收,分离纯化与制备可同
步完成,故特别适于制备性分离;( 3 ) 操作简便。
因固定相为液体,体系更换与平衡方便、快捷。与HPLC 相比,HSCCC 进样量较大,最多可达数克,是H P L C 的数百倍;与常压、低压色谱相比,HSCCC 的分离能力强,有些样品经一次分离即得到1 个甚至多个单体,且分离时间短,数小时即可完成,纯度多在98%以上。分离效果主要与溶剂体系的选择和旋转速度、样品制备、洗脱方法等有关。
2 分离植物有效成分
2.1 生物碱类
生物碱是重要的天然含氮化合物,对疾病治疗和药物发展等具有重要作用。生物碱在植物中分布非常广泛,至少有50多科120属植物中含有生物碱。近年,用HSCCC 已成功分离了多种生物碱。
黄连是重要的中草药,具有抗氧化作用,可治疗头晕、风湿及疲劳等。黄连中主要的生物活性物质包括巴马亭、小檗碱、表小檗碱和黄连碱等。Yang等[1]以氯仿- 甲醇-0.2mol/L 盐酸(4∶1.5∶20)为两相溶剂,利用HSCCC分离得上述4 种生物碱。紫杉醇为抗癌药物,属于二萜类生物碱,碱性极弱,Chiou等[2]采用正己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 乙醇- 水(5∶7∶5 ∶1 ∶6 . 5 ) 五元体系分离了紫杉醇和类似物caphalomannine。其它生物碱分离实例[3~10]见表1。

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2.2 黄酮类
黄酮类化合物多存在于高等植物和羊齿类植物中,常以游离或与糖成苷的形式存在,在花、叶、果实等组织中多为苷类,而在木质部组织中多为游离苷元。主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶精、花色素等及各种衍生物。
黄芪具有抗疲劳、免疫刺激和强心等功效。药理和临床实验表明,黄芪中的异黄酮类具有杀菌和清除超氧化阴离子的活性。Ma 等[11]利用HSCCC,以乙酸乙酯- 甲醇- 乙酸- 水( 4∶1 ∶0.25∶5) 为溶剂系统,从黄芪粗提物中出分离出两种异黄酮,纯度均大于95%。Du 等[12]利用正己烷- 乙酸乙酯-正丁醇- 甲醇- 乙酸- 水( 1 ∶2 ∶1 ∶1 ∶5 ∶1 ) 从大豆中分离出4 种异黄酮,纯度均大于90 %。其他不同植物中黄酮类成分的分离实例见表2。

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2.3 蒽醌类
蒽醌类化合物是广泛存在的重要天然色素,尤其在高等植物和真菌、地衣等低等植物中更为普遍。袁黎明等[21]利用HSCCC 对传统中药大黄中的蒽醌类活性成分进行了制备性分离研究,采用氯仿- 甲醇- 水( 4∶3.8∶2) 溶剂系统,分离效果良好。Yang 等[22]利用乙醚- 水的两相溶剂系统,通过调整流动相pH 值,采用梯度洗脱,从大黄中分离了大黄酚、大黄素、大黄素甲醚等羟基蒽醌类化合物,纯度均大于98%。此外,采用氯仿- 甲醇-丙酮- 水( 9∶8∶1∶8) 分离芦荟中的蒽醌类物质,得到纯度为95.7%的芦荟大黄素和98.9%的芦荟大黄素甙[ 23] 。
2.4 酚类和脂肪酸类
HSCCC对酚类和脂肪酸类物质也有良好的分离效果。丹参的药用有效成分主要为丹参酮类和丹参酚酸,近年的研究多集中于后者。丹参酚酸是水溶性酚类化合物,具有抑制动脉血管内皮舒张、降血压和保护肝脏等活性。Li等[24]采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇- 水( 3 ∶7 ∶1 ∶9 ) 为溶剂系统,利用HSCCC从丹参粗提物500mg中得到纯度大于98%的丹参酚酸B 342mg。Tian 等[25]则从山茱萸的正丁醇提取物中,以乙酸乙酯- 正丁醇- 水(5∶1.8∶6)与乙酸乙酯- 乙醇- 水( 5∶0.5∶6) 两步分离得到没食子酸,纯度大于9 7 %。
3 从微生物和藻类中提取有效成分
类胡萝卜素主要来自高等植物和藻类,具有抗癌、抑制溃疡、防治心脏病等功效,其在藻类中可利用生物反应器大规模连续生产。虾青素是类胡萝卜素中抗氧化活性最强的物质,Li 等[26]利用HSCCC,采用正己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水( 5∶5∶6.5∶3)溶剂体系,经一步纯化,从粗品中分离出纯度大于97%的虾青素。此外,用正己烷- 乙醇- 水(4∶3∶1)可从微藻中分离出纯度为98%的叶黄素[27]。
红曲色素是以微生物法生产的天然食用色素,是红曲菌属真菌发酵粮食所得的代谢产物。目前结构已知的有红色素类、紫红色素类和黄色素类3种。夏明等[28]利用HSCCC,采用石油醚-甲醇-乙酸乙酯- 水( 3∶6∶5∶4) 为两相溶剂,成功分离了上述3 种色素。
此外,Lu 等[29]用正己烷- 甲醇(2∶1)体系从微藻Thraustochytrium ATCC26185中分离得到纯度大于9 5 %的鲨烯。
4 抗生素的分离纯化
抗生素的分离制备也可采用HSCCC,须注意以下几点[30]:(1)选择极性两相溶剂体系,保证有效组分能够充分溶解;( 2) 加入适量的疏水性有机溶剂,调整有效组分的分离系数;( 3) 溶剂体系中加入有机酸,使大部分有效组分进入有机相中;(4)采用低流速进样(0.5ml/min)。
Oka 等[31]采用正己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水(3∶6∶5∶5) 分离得到纯度分别为98. 2%、92 .3 %、97.4%的螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。Harada 等[ 30]采用正丁醇- 乙酸乙酯-0.005mol/L 三氟乙酸(1.25∶3.75∶5)的溶剂体系,从Lysobacter 发酵液分离的WAP-8294A混合物中分离得到了对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有较强抗性的WAP-8294 A2。
5 总结
HSCCC 是一种有独特优势的液相分配色谱技术。其溶剂系统更换灵活,能实现从微克量级的分离分析到克量级的分离制备;可用于天然产物粗提物的去除杂质和单个产物的精制;也可与质谱仪或红外光谱联用进行高纯度分析。HSCCC 有望在标准品的制备、天然产物化学成分研究及新药研发等领域得到更广泛的应用。
参考文献(略) 7/23/2009


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